第三个故事 “最接近”的现有技术

案件经过

第三个故事所涉及的专利申请为CN201380072477.4，申请日2013年12月5日，发明名称为“基于CRISPR的基因组修饰和调控”，该专利申请于2018年7月3日授权公告。专利权人为西格玛-奥吉奇公司（Sigma Aldrich Co LLC）。

本专利申请涉及向真核细胞或胚胎的特定靶位点引入外源染色体序列，即一种knock-in基因编辑的方法。

该专利申请在进中国国家阶段时的权利要求13为：

13.用于修饰真核细胞或胚胎中的染色体序列的方法，所述方法包括：

A）向真核细胞或胚胎引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种编码至少一种指导RNA的指导RNA或DNA，和任选，(iii)至少一种供体多核苷酸；和

B）培养所述真核细胞或胚胎使得各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入该靶位点，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述染色体序列被修饰。

OA1

在OA1中，审查员认为权利要求13对应于对比文件1（US 2010/0076057A1）没有创造性。

具体而言，对比文件1涉及一种在真核细胞中抑制靶DNA序列的功能和/或存在的方法，该方法包括向包含靶DNA的真核细胞施用crRNA和一种或多种Cas蛋白（例如Cas3蛋白），或编码所述一种或多种Cas蛋白的核酸序列，其中所述crRNA与所述靶DNA序列（原文为a target DNA sequence）杂交，从而干扰所述靶DNA序列的功能和/或存在（参见以下的对比文件1的权利要求1）。

1.A method of inhibiting the function and/or presence of a target DNA sequence in a eukaryotic cell comprising: administering crRNA and one or more cas proteins, or nucleic acid sequences encoding said one or more cas proteins, to a eukaryotic cell comprising a target DNA sequence, wherein said crRNA hybridizes with said target DNA sequence thereby interfering with the function and/or presence of said target DNA sequence.

审查员还列举了对比文件1中的实施例1和实施例3，这些实施例也仅仅涉及“敲除”相关的技术方案。可见，对比文件1提供的是一种敲除靶DNA序列和/或抑制其功能的方法。

然而，该专利申请涉及的却是一种向真核细胞的特定靶位点引入外源染色体序列（即“整合”供体序列）的方法。

为了进一步突出该专利申请所解决的技术问题是什么，权利要求13在答复OA1时被修改至以下的形式：

1、用于通过整合供体序列而修饰真核细胞中的染色体序列的方法，所述方法包括：

A）向真核细胞引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的密码子优化的核酸，(ii)至少一种编码至少一种指导RNA的指导RNA或DNA, 和(iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷酸；和

B）培养所述真核细胞使得各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入该靶位点，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述染色体序列通过将供体序列插入或置换到染色体序列而被修饰。

可见该修改后的权利要求进一步明确提供一种将供体序列插入或置换到原染色体序列的方法。

OA2

OA2没有引用额外的对比文件。审查员认为对比文件1的权利要求1涉及在真核细胞中导入目标DNA序列以修饰染色体的方法，并且认为该目标DNA序列对应于该权利要求中的“供体序列”。同时其还认为对比文件1实施例2（即Interference in Eukaryotes）也采用了包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶，因此对比文件1提供了获得该权利要求的技术方案的启示。

然而由于对比文件1整体而言没有真正涉及knock-in基因编辑的内容，没有提供真正的“供体序列”，也没有解决将外源序列整合入真核细胞染色体的技术问题，因此将对比文件1作为“最接近的现有技术”是有待商榷的。换言之，即使对比文件1确可作为最接近的现有技术，其对该专利申请创造性的影响也非常有限。

同时对比文件2仅涉及了一种CRISPR/Cas9蛋白-RNA复合体；对比文件3仅涉及一种Cas9-crRNA核酸内切酶复合体，可见对比文件2-3和该专利申请相比，仅涉及某一技术特征，更没有涉及相关的技术方案。

最终申请人将权利要求修改至如下的形式并获得了授权：

1.用于整合外源序列到真核细胞的染色体序列的方法，所述方法包括：

a)向真核细胞引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的核酸，其中所述至少一种RNA指导的核酸内切酶是成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)(CRISPR/Cas)类型II系统蛋白并且所述CRISPR/Cas类型II系统蛋白是Cas9蛋白，

(ii)至少一种编码至少一种指导RNA的指导RNA或DNA，和

(iii)至少一种包含外源序列的供体多核苷酸；和

b)培养所述真核细胞使得所述指导RNA将所述RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点和原间隔毗连基序(PAM) ，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述外源序列整合到染色体序列。

从授权的权利要求1的保护范围看，其保护了在真核细胞中利用CRISPR/Cas9通过双链断裂的修复将外源序列整合到染色体序列的方法，保护范围依然是相当大的。该专利作为一种平台专利可以对knock-in基因编辑修饰进行较大的力度的保护。

TiPLaber说

在争辩创造性时，首先要明确本申请的发明点。即本申请究竟利用何种技术方案解决了何种技术问题。例如，针对本文讨论的专利申请，其利用1、包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码该核酸内切酶的核苷酸序列；2、指导RNA和3、包含外源序列的供体多核苷酸，通过修复在真核细胞染色体的特定位置产生的双链断裂，在该位置整合入外源序列。

在发明点的基础上，再进一步审视对比文件公开了哪些相关内容，是否会导致需要重新界定所解决的技术问题。如果需要，则考虑是否需要进一步地修改权利要求，使其包含为解决该新界定的技术问题所必需的技术特征。如果不需要，则是否在目前技术方案和技术问题的基础上，就可以争辩该权利要求的技术方案是非显而易见的。对于本文讨论的专利申请，对比文件1与其技术方案相差较大，为了突出其所解决的问题是“整合外源序列到真核细胞的染色体序列”，对权利要求进行了相应的修改。由此可见，发明点的明确是做好创造性答复工作的前提和基础，也是客观看待审查意见通知书的基础。

CRISPR/Cas相关技术相比于生物医药领域其他技术内容的更为复杂，因此也更需要理解本申请和对比文件各自的技术方案。

同时，在原始CRISPR/Cas系统的基础上CRISPR/Cas技术的更新迭代也层出不穷（例如，不同的性质的Cas相关蛋白质或变体、CRISPR/Cas的新用途，例如单链断裂、单核酸定点修饰、通过竞争结合阻断 DNA序列、调节DNA切割精确度、治疗临床适应症等），其改进是否是“显而易见的”很可能与其结果能否基于现有技术水平而被预测相关。实际上CRISPR/Cas技术领域UC和Board关于原核细胞与真核细胞经典之争也在于判断基于在现有技术水平是否能够预测不同类型细胞环境的结果。因此可以预见，随着CRISPR/Cas技术的不断突破，今后获得保护范围极大的CRISPR/Cas技术专利的难度会水涨船高。

由此可见，在撰写早期明确复杂技术背后本质的发明点也就尤为重要了。

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