RNAi领域的开创性专利
涉及RNAi机理和早期siRNA结构主要包括Carnegie专利、Tuschl I专利、Tuschl II专利和Kreutzer-Limmer 专利。
从保护主题上看，Carnegie专利涉及使用 dsRNA 诱导 RNAi的方法，Tuschl I专利、Tuschl II专利和Kreutzer-Limmer 专利均涉及dsRNA的结构特征。
下面我们将逐个展开这些专利背后的故事。
Carnegie专利—在线虫中使用dsRNA介导RNAi
我们在序中提到，1998 年，Andrew Fire 和 Craig Mello 在秀丽隐杆线虫中发现了RNAi的现象。这项工作分别是Fire在华盛顿卡内基研究所（Carnegie Institution of Washington）和Mello在马萨诸塞大学医学院（University of Massachusetts Medical School）完成的。
当时他们递交的相关专利家族为PCT/US1998/027233，通常称之为Carnegie专利。该专利家族均已经于2018年到期。
Carnegie专利主要涉及使用 dsRNA 诱导 RNAi，包括在动物细胞或植物细胞中，但并未涵盖对于能够在哺乳动物细胞中使用的 siRNA 的结构特征。
其中，比较具有代表性的是US8283329B2，发明点在于抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的方法。权利要求中对于dsRNA是采用功能性限定的方式，体现了RNAi的作用机理，该专利可以阻止第三方使用siRNA治疗疾病的应用，而不论其具体结构。
“2. A method to inhibit expression of a target gene in an animal cell comprising introducing into said cell double-stranded ribonucleotide (RNA) comprising a first RNA consisting essentially of a ribonucleotide sequence which corresponds to a nucleotide sequence of the target gene and a second RNA which consists essentially of a ribonucleotide sequence which is complementary to the nucleotide sequence of the target gene and wherein said first and second RNAs are present in an amount sufficient to inhibit the expression of the target gene.”
权利要求中的相关特征包括：“第一RNA链基本上由对应于靶基因的核苷酸序列的核糖核苷酸序列组成，第二RNA链基本上由与靶基因的核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列组成”，另外，限定第一和第二RNA足以抑制靶基因表达的量存在。
Carnegie专利主要是以非独占许可的方式广泛授权给第三方使用。其中，Alnylam也获得了Carnegie专利的非独占许可，以用于治疗目的。
当时Fire和Mello只涉及长度为 25 个或更多核苷酸的 RNA 分子，这些分子可以引发免疫反应，使其不适合临床使用。
Tuschl I专利—21-23 nt的siRNA介导RNAi
2000年，Phillip D. Zamore（马萨诸塞大学，UMass）、Thomas Tuschl（Max-Planck-Institute）、Phillip A. Sharp （麻省理工学院，MIT）和 David P. Bartel（Whitehead Institute）在Cell上的一篇工作揭示了使用果蝇体外系统发现在RNAi过程中，dsRNA被加工成21-23 nt的小RNA片段并指导mRNA切割，这个过程是序列特异性的（参见：10.1016/S0092-8674(00)80620-0，2000）。
之后Tuschl等人在果蝇体外系统中使用化学合成的具有3’突出端的21 和 22 nt RNA介导序列特异性 mRNA 的降解，表明靶向步骤可以与dsRNA的加工步骤分离，Tuschl将这种短的RNA定义为siRNA，可以避免长dsRNA引发的非特异性干扰素反应，从而应用于疾病治疗。
基于上述研究工作，他们递交了相关专利，家族为PCT/US2001/010188，即为Tuschl I专利。该专利家族已经于2021年到期。
Tuschl I专利主要涉及使用21-23个核苷酸的siRNA分子或其介导RNA干扰的方法。
其中代表性专利之一US8552171B2的发明点在于具有21-23个核苷酸的siRNA分子介导哺乳动物细胞中mRNA的裂解，能够阻止第三方使用21-23个核苷酸的siRNA，其权利要求如下：
“1. An isolated double-stranded RNA molecule of from 21 to 23 nucleotides, in the form of two separate RNA strands which are not covalently linked, that is perfectly complementary to an mRNA to mediate RNA interference by directing cleavage of the mRNA within the region that is perfectly complementary with the isolated RNA molecule, wherein the mRNA is a mammalian cellular mRNA.”
Zamore、Tuschl、Sharp 和Bartel均是Alnylam的早期创始人，他们希望获得Tuschl I的独占许可。Tuschl I的专利申请人涉及到四个主体：UMass、Max-Planck-Institute、MIT和Whitehead Institute，UMass不同意将其权利授权给Alnylam，而是授权给了Sirna Therapeutics，因此，Alnylam和UMass就Tuschl I专利共同享有独占权。
2009 年， Max Planck 和 Alnylam 对 UMass、Whitehead 和 MIT发起诉讼，Alnylam 和 Max Planck 称其 Tuschl II 的数据被错误地记载在仍在审理中的 Tuschl I 专利申请中，两年后达成和解。
后来Alnylam 以 1.75 亿美元从默克收购了 Sirna之后才获得Tuschl I的独家权利。
Tuschl II专利—siRNA 的关键结构设计（长度、3’突出端和修饰）
紧接着2001年，Max-Planck-Institute的Tuschl、Sayda M. Elbashir和Winfried Lendeckel等人验证了在人类细胞中使用化学合成的具有3’突出端的并互补配对的21个核苷酸 (nt) 的siRNA可以诱导序列特异性的 RNAi 沉默。
基于在人类细胞中发挥作用的siRNA结构，Tuschl等人递交了相关专利家族PCT/EP2001/013968，即为Tuschl II专利，在中美欧日均获得了授权，且已经于2021年到期。
Tuschl II专利主要涉及具有特定长度的siRNA分子（比如：19-25 nt）、包括短的3’突出端（比如：1-5 nt）或其化学修饰（比如：糖环上2’-OH取代）。其中，3’突出端可以提高dsRNA的稳定性，使其免受降解，且不影响RNAi的效果。过长的突出端会影响RNAi。反义链突出端的序列也会影响siRNA的活性，与野生型序列 UG 或突变体 UU 相比，具有 AA、CC 或 GG 的反义 siRNA 3’ 突出端的 siRNA 双链体的活性降低了 2 到 4 倍，可能是由于3’ 突出端的倒数第二个核苷酸影响靶标 RNA 切割。
代表性专利之一US8372968B2主要涵盖具有19-25个核苷酸的siRNA分子，包括3’突出端，能够阻止第三方使用具有1-5 nt的3’突出端且19-25 nt的siRNA且不论其是否具有其他修饰，权利要求1如下：
“1. An isolated double-stranded RNA molecule, which is a non-enzymatically processed RNA molecule, wherein:
(i)each RNA strand independently consists of 19-25 nucleotides in length, and (ii) at least one RNA strand forms a single-stranded 3’-overhang from 1 to 5 nucleotides, wherein said RNA molecule is capable of target-specific RNA interference.”
Alnylam从Max Planck获得了Tuschl II专利的独占许可。
Kreutzer-Limmer 专利—涉及dsRNA的结构特征
Kreutzer-Limmer 专利的最早优先权日略早于Tuschl专利，也是dsRNA领域内早期较重要的专利，这些专利家族属于德国初创公司Ribopharma。2003年，Alnylam通过收购 Ribopharma拥有整个 Kreutzer-Limmer 专利组合。
Kreutzer-Limmer 专利系列包含多个专利家族，主要是涉及dsRNA的结构特征，包括长度、末端修饰、反义链的错配或靶向肿瘤的dsRNA等。这些专利的保护形式比较多样，为后来的竞争者造成了障碍。
四大专利家族构筑的专利壁垒
最初Andrew Fire 和 Craig Mello在线虫中发现RNAi现象并递交Carnegie专利，主要涉及使用 dsRNA 诱导 RNAi的方法，并不涵盖siRNA的结构特征。
Zamore和Tuschl等人在果蝇体系中进一步探索RNAi的机理，从而将 21-23 nt的dsRNA定义为siRNA，并使用化学合成的siRNA成功介导RNAi，验证了其应用于疾病治疗的潜力，他们递交了Tuschl I专利，主要涉及siRNA分子或使用其介导RNA干扰。
在此基础上，Tuschl等人进一步优化siRNA的关键结构，使其更好应用于疾病治疗领域，并获得了Tuschl II专利，主要涵盖包括3’突出端的siRNA。
Kreutzer-Limmer 专利略早于Tuschl专利，也主要围绕dsRNA的结构特征，包括长度、末端修饰、反义链错配等结构特征。
这些涵盖机理和基本结构特征的专利为开发其治疗应用的公司设下了难以跨越的障碍，其中挺多专利都经历过诉讼，比如：围绕发明人资格或专利的有效性等，从侧面也体现出这些专利的价值以及对竞争者的商业进程所造成的影响。siRNA领域的先行者Alnylam通过从研究机构许可或收购等方式获得了这些专利的非独占或独占许可，一方面为其后续药物的顺利上市早早扫清了障碍，另一方面也建立起自身的竞争优势。
好在这些专利的申请日均比较早，对于后来才进入siRNA领域的竞争者来说影响比较有限，但从这些专利中我们也可以感受到领域内开拓者所具备的天然竞争优势，当然这离不开当时这些专利确实对技术进行了比较好的保护，才得以将技术优势转化为商业优势。
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