在上一篇序中我们提到，AAV凭借衣壳蛋白的天然靶向性能够将基因精准地递送到特定细胞或组织，主要是依赖AAV衣壳表面的配体与靶细胞表面的天然受体的相互作用。AAV衣壳蛋白与细胞表面特定受体结合后，通过网络蛋白介导的内吞作用进入核内体。由于核内体的pH值较低，AAV衣壳的VP1/VP2区域发生构象变化，从而触发AAV核内体逃逸，进入细胞核内并脱壳、释放携带的目的基因，随后目的基因在核内酶的作用下形成完整双链，转录、翻译表达目的蛋白，而衣壳蛋白会被蛋白酶体降解。

理性设计和定向进化

了解影响AAV转导效率的主要因素，更有利于理解衣壳工程化技术的发展。目前发现影响AAV转导的两个主要因素是：是否能够进入细胞，以及进入后是否容易被降解。

不同血清型的AAV因为编码的衣壳蛋白上的配体不同，对不同组织或细胞的转导效率不同。因此，首先了解AAV衣壳蛋白哪段区域为决定是否能够进入细胞的受体结合区，是工程化改造AAV衣壳以重塑转导对象或提高其转导效率的关键步骤。除了决定是否能够进入细胞的受体结合区之外，大家发现即使AAV成功穿越细胞膜进入胞内，因为衣壳表面某些氨基酸的介导，AAV会被胞内酶降解，因此找到影响胞内降解的关键氨基酸残基，也是提高AAV转导效率的另一个重要因素。

AAV转导机理的解析催生出了理性设计手段，而为了克服转导机理解析的局限性，又发展出了定向进化手段。

随着AAV衣壳结构，以及细胞受体结合关键区域和影响胞内降解的关键氨基酸残基相关的机理逐渐被解析，领域内衍生出了2种手段，一种是在细胞受体结合关键区域插入特异性靶向肽以重塑转导对象，使其转导原本无法进入的组织或者细胞；另一种则是对影响胞内降解的关键氨基酸进行突变，以避免AAV衣壳被降解来提高AAV转导效率。这也就是衣壳工程化早期方向——理性设计（Rational Design）。

理性设计极大地依赖AAV转导机理的解析，比如在受体结合关键区域插入靶向性的肽，首先要知道AAV衣壳表面影响受体结合的关键区域，还要清楚想要转导的细胞表面受体具体结合的肽序列。在不知道这两部分的情况下，特别是对于一些想要转导的组织或细胞表面受体结合的肽仍然不清楚，理性设计就会受限。这种技术限制随后就衍生出了衣壳工程化的另一个方向——定向进化（Direct Evolution）。

在不需要充分了解衣壳蛋白在细胞表面的结合、胞内的降解等方面的机理的情况下，定向进化直接建立高度多样性的AAV衣壳文库，然后模拟自然进化，在选择性的压力下针对特定组织或细胞筛选出相应高转导效率的工程化衣壳。随着文库测序技术的成熟，定向进化已经成为当下高效工程化改造AAV衣壳的方向。

根据定向进化衣壳文库的建立手段不同，定向进化又分为：

1）随机肽展示文库：与理性设计类似，在影响细胞受体结合的关键区域插入肽段，但是区别在于插入的肽种类为成千上万条，它们编码7-9个长度的随机蛋白片段，该方法也是目前热度比较高的方法之一，明星载体-AAV7m8（视网膜细胞特异性）、AAV9.PHB（CNS特异性）就涉及此方法；

2）易错PCR文库：利用易错PCR对AAV衣壳中的离散区域或整个衣壳基因进行随机突变，比如对干细胞具有特异性的EP1.9就是通过筛选这类文库得到；

3）衣壳重组文库：利用AAV血清型之间的高度同源片段，尤其是衣壳中的可变区域，将来自不同血清型的AAV衣壳基因拆分成多个片段并随机重组成新的衣壳基因，以此来构建一个包含大量嵌合衣壳的文库，对肝脏具有高效转导能力的AAVDJ、AAV-LK03就是通过这种方法得到。

随着下一代测序、基于AI的机器学习和生物信息学衣壳预测等计算机方法的不断成熟，衣壳工程化领域也开始使用计算机设计（Computational Design）新AAV衣壳，比如对小鼠肌肉、视网膜和耳蜗具有高效转导效率的Anc80。

工程化改造位置、内容和手段三种风险

衣壳工程化技术伴随着工程化改造位置、内容和手段三种维度的发明，这也构成了Biotech使用工程化AAV衣壳的风险来源。

从衣壳工程化技术的发展来看，早期存在着衣壳蛋白上影响转导效率的关键区域或氨基酸残基相关的发明，这也是领域内具有里程碑意义的基础发明，因为后期的理性设计和定向进化的一些手段都是在此基础上开展；在位点被解析清楚之后，存在着靶向性肽序列和突变后的氨基酸，以及被改造后的衣壳变体完整序列相关的发明；在技术发展过程中，还伴随着工程化手段相关的发明。

那么总结上述发明维度，对于想要使用理性设计工程化改造AAV衣壳的Biotech来说，主要存在三类潜在风险：

I-工程化改造位置：衣壳蛋白表面影响转导效率的细胞受体结合区域，或影响胞内降解的氨基酸残基；

II-工程化改造内容：在改造位置插入的靶向性肽，或者突变后氨基酸类型，以及修饰后的衣壳完整序列；

III-工程化改造手段：在改造位置插入靶向性肽以重塑衣壳转导对象的理性设计理念，或者不同建立或筛选定向进化文库的方法等。

对于不同类型的Biotech，我们认为需要关注的风险重点不同。对于直接使用领域内现有的或者已验证的工程化AAV衣壳的企业来说，因为本身不涉及改造手段，主要需要关注I和II来源的风险；而对于选择通过理性设计或定向进化等手段从头开发工程化衣壳来递送药物的企业来说，因为改造内容相对来说会区别于领域内现有技术，则更需要关注风险I和III。

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