双特异性抗体的独特优势
双特异性抗体 (Bispecific antibodies，BsAbs)可以同时识别相同或不同抗原上的两个不同表位，克服传统单抗的缺点并改善其疗效，能够应用于多个治疗领域，比如：癌症、慢性炎症性疾病、自身免疫疾病以及感染等。
生产双特异性抗体的主要技术难点在于获得正确配对的双特异性抗体，全球首个获批的双特异性抗体catumaxomab采用了triomab quadroma平台技术—将两个杂交瘤细胞融合获得双特异性抗体。目前，已经开发了大约23个生产双特异性抗体的平台技术。
生物药的开发通常伴随着高额的研发成本和漫长的研发周期，双特异性抗体也无例外。在一个领域的发展初期，各种平台技术是玩家们击败其它竞争对手的有力武器。
保护这些平台技术的专利则是收回高额的研发成本不可或缺的工具，不难想象，随着这一领域的快速发展，保护这些平台技术的专利申请将不断增加，并为竞争对手们设下重重障碍。
BsAbs按照结构可以分为两大类：包含Fc区 (IgG样)的对称和不对称双特异性抗体与不含Fc区的双特异性抗体，两类抗体的主要区别在于药代动力学性质和效应子功能不同。
这篇文章我们主要介绍包含Fc区的代表性双特异性抗体。
保护不对称双特异性抗体的专利申请
Triomab quadroma
Triomab quadroma技术是将CD3特异性大鼠源IgG2b 抗体和肿瘤靶向小鼠源IgG2a抗体进行体细胞杂交获得的双特异性抗体，由Fresenius和Trion Pharma 公司合作开发，解决了HC/HC和LC/HC错配问题。
1995年递交的PCT专利申请 (PCT/EP1995/001850)请求保护triomab quadroma技术，权利要求1涉及一种生产异源双特异性抗体的方法，利用纯化过程中大鼠和小鼠抗体对蛋白质A不同的亲和力来获得双特异性抗体。利用此技术开发的catumaxomab (EpCAM×CD3)于2009年被欧盟批准上市用于治疗EpCAM阳性肿瘤所引起的恶性腹水。
KiH (Knob-into-hole)
20世纪90年代，Genentech使用KiH技术对HC进行工程化以获得异源二聚体，是解决HC/HC问题的一大突破。KiH技术在其中一条重链的CH3区引入突变，形成一个凸起的类似“杵”的结构，在另一条的重链的CH3区发生突变形成一个凹陷的“臼”的结构，杵臼结构设计有利于两种异源抗体重链的正确装配。
1996年，Genentech递交了涉及KiH技术的PCT专利申请 (PCT/US1996/001598)，进入US国家阶段的授权专利为US5731168A，并获得了多个延续案。
CrossMab
CrossMAb技术由Roche开发而成，并在PCT/EP2008/010702专利申请中披露了这一技术。涉及对Fab区其中一对HC和LC的结构域进行互换来解决LC/HC错配问题，这种互换技术保留了原始的抗原亲和力。
通常有三种方式实现：交换VHb和VLb，交换CH1b和CLb以及交换VHb-CH1b和VLb-CLb。
PCT/EP2008/010702进入CN国家阶段的授权专利 (CN101896504B)的权利要求1保护一种二价双特异性抗体，包括：
特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；和
特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换。即对其中一对重链和轻链的可变和恒定结构域同时进行了替换。
使用CrossMAb和KiH两种技术同时克服LC/HC和HC/HC错配问题。例如，
vanucizumab (Ang-2×VEGF)，通过CrossMAb技术对Ang-2 抗体Fab结构域中的CL与CH1进行互换，而VEGF抗体的Fab结构则保持不变，经过改造的Ang-2抗体轻链不易与VEGF抗体的重链发生错配，同时“knob-into-hole”结构可促进两条重链异源二聚化。
目前vanucizumab处于治疗结直肠癌临床2期研究阶段。Roche于2011递交了涉及vanucizumab的PCT专利申请 (PCT/EP2011/054504)，并已经在US、CN、EP、JP等多个国家获得了授权。
ART-Ig和BiMab技术
ART-Ig和BiMab技术都是利用静电转向突变 (Electrostatic steering mutations)技术以解决HC/HC的错配问题，即在两条不同重链的CH3结构域分别引入带负电和带正电的氨基酸残基，以通过静电吸引作用增加异源二聚体的形成，并通过静电排斥作用减少同源二聚体的形成。LC/HC的错配问题则通过使用相同的LCs来解决。
ART-Ig技术
2006年，Chugai递交了涉及ART-Ig (Asymmetric re-engineering technology-immunoglobulin)技术的PCT国际申请 (公开号：PCT/JP2006/306803)，并在US和CN等国家获得了授权 (US10011858B2和CN101198698B)，均保护一种多特异性抗体的生产方法，并限定了CH3结构域的一些氨基酸突变位点。
Chugai利用ART-Ig技术开发了ACE910 (即为后来的emicizumab)，并于2017年获得FDA批准用于治疗A型血友病。
BiMab技术
Oncomed递交的相关专利家族 (PCT/US2010/032625)涉及BiMab技术，中国授权专利CN102459346B保护一种双特异性抗体，包含在CH3结构域上具有氨基酸取代的两条多肽。
Oncomed利用BiMab技术开发了navicixizumab(DLL4×VEGF，代号OMP-305B83)，目前正在进行治疗不同癌症 (比如：结肠直肠癌和卵巢癌)的1期临床研究阶段。
涉及navicixizumab的专利申请PCT/US2012/056886于2012年递交，在中国已获得授权 (CN104168914B)。
DuoBody
Van der Neut Kolfschoten等人发现Fab臂交换 (Fab arm exchange)现象是人体内的IgG4抗体天然发生的一个过程，可以形成半抗体或双特异性抗体 (Van der Neut Kolfschoten et al., Science 2007, 317: 1554-7.)。
Genmab对Fab臂交换机制进行了深入研究，并开发了可以产生稳定双特异性IgG1抗体的DuoBody平台技术：
首先分别表达两个IgG1抗体，两个抗体的CH3区域分别引入一些突变位点以解决HC/HC错配问题；
之后混合两个目标抗体，在还原剂 (如GSH等)作用下，形成半抗体并重新组装形成IgG1双特异性抗体。
这一技术最初在PCT/EP2011/056388中得以披露，涉及一种在体外形成双特异性抗体的方法，相应的美国专利已经获得授权—US9150663B2，中国专利申请CN103097417A仍处在审查阶段。
Labrijn等人已经证实DuoBody技术与大规模抗体生产相兼容并确保bsAbs的效应子功能和体内稳定性 (Labrijn et al, PNAS 2013;110(13):5145-5150)。
Genmab已经与多个大型制药公司如杨森、诺华和吉利德等达成了合作协议，共同开发双特异性抗体药物。其中，与杨森 (Janssen)合作开发的两款BsAbs—JNJ-61186372 (EGFR×cMET，PCT/US2013/071288)和JNJ-63709178 (CD3×CD123，PCT/US2015/048316)分别处于治疗非小细胞肺癌和急性髓性白血病的1期临床研究。
对称双特异性抗体
DVD-Ig
DVD-Ig (Dual Variable Domain-Ig)技术由Abbott开发而成，通过在正常IgG抗体的轻链和重链的N末端或C末端连接另外的VH或VL结构域以形成双特异性抗体。
Abbott在PCT/US2007/017340中公开了这一技术，请求保护一种包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n结构的结合蛋白。DVD-Ig的一个优势在于多个可变区都能够与抗原同时结合，因此具有更高的特异性结合能力。
Lutikizumab (IL-1α × IL-1β，ABT-981)目前正处于治疗骨关节炎的2期临床研究阶段，Abbott递交的PCT/US2007/026482专利家族涉及对lutikizumab进行了保护。
Two-in-one/DAF
Two-in-one技术也用来解决LC/HC和HC/HC错配问题，由Genentech的Bostrom等人开发而成，对可变区进行工程化并通过噬菌体展示获得识别两个不同的靶点的双特异性抗体，又称为DAF抗体(Dual Action Fab，DAF)。
Two-in-one双特异性抗体保持了正常IgG抗体的结构，易于进行产业化生产，技术难点在于前期的工程化过程。
PCT/US2007/018385对two-in-one技术进行了保护，涉及一种多特异性抗体的制备方法，包括对抗体的VL结构域进行工程化并选择能够结合第一和第二表位的多特异性抗体。
Roche基于two-in-one技术开发的duligotuzumab (EGFR × HER3，MEHD7945A)目前正处于治疗头颈癌和结直肠癌的2期临床试验中，递交的PCT/US2010/028023专利家族涉及对duligotuzumab活性成分的保护，中国的授权专利公告号为CN102356092B。
以上主要介绍了包含Fc区的双特异性抗体的平台技术，我们将在下一篇文章中继续探讨不含Fc区的代表性双特异性抗体平台技术及其专利保护。
* 以上文字仅为促进讨论与交流，不构成法律意见或咨询建议。