我们先来回顾一下“工程化tRNA矫正密码子层面错误”的主要应用场景。无义突变，由于mRNA正确的密码子突变为终止密码子（或称为“提前终止密码子”，PTC），导致翻译过程的提前终止，从而无法合成正确长度的肽链从而引起相关疾病。tRNA疗法在矫正无义突变的应用时，主要依靠的是工程化后的tRNA具备通读PTC的能力（图1）。而第一类改造“解码钥匙”的设计思路，主要是突变tRNA的反义密码子区，使其能够结合突变后的终止密码子而实现PTC通读。那么第二类增加“解码钥匙”有什么不同呢？

第二类：针对“错误密码”，增加“解码钥匙”

整体上来说，第二类策略在技术特征层面分类同样包括：工程化tRNA、核酸的修饰以及体内递送，与第一类策略主要差异体现在工程化tRNA部分，以下就该部分进行展开。

如果说第一类tRNA疗法的设计思路是“改造已有的解码钥匙，使其能够解码出错的密码”，那么第二类tRNA疗法的设计思路就是“拓宽解码本，增加解码钥匙的多样性，实现在翻译过程中的错误矫正”。

除改造tRNA外，第二类方法还额外改造了氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetase，AARS），改造后的AARS能够催化tRNA 5’末端缀合非天然氨基酸。拓宽的解码本即为61种密码子编码的氨基酸之外的非天然氨基酸（图2），而钥匙类型的多样性，则是增加了缀合非天然氨基酸的工程化tRNA，这类tRNA的工程化是根据过早终止密码子类型和非天然氨基酸综合考虑设计的。

因此可以说第二类方法重构了一套“新的翻译系统”，包括tRNA前置成熟过程中所需的非天然氨基酸及改造的AARS酶，还有最终在核糖体中发挥翻译作用的工程化tRNA。在这套新的翻译系统中，工程化tRNA经改造后，反义密码子区能够结合过早终止密码子，同时它也不再被任何内源AARS氨酰化，只能在改造的AARS的催化下缀合非天然氨基酸；而改造的AARS酶，也无法氨酰化细胞内原有的tRNA，系统中各组件的配合运作是绝对契合的。

国内北京大学夏青教授团队，2021年发表的文章使用这种策略开发用于杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的相关疗法，重构的系统为“PyIRs-tRNA system”（图3），包含工程化tRNA、非天然氨基酸（unnatural amino acid，UAA）和对应改造的AARS（图中为PyIRS）。

随着该类技术的发展与体内效果的进一步验证，目前的研究也不再仅局限于技术可行性上，更加深入的解决例如效率低等相关技术问题。由于第二类重构的翻译系统需要额外提供UAA，后续夏青教授团队为了提高这类疗法中由UAA掺入效率低引起的效果差的问题，进一步改良了UAA的配方，实现了通过口服即可提高生物利用度和组织积累效果（图4）。

就非天然氨基酸拓展基因密码子的相关技术而言，在此之前领域内也已开展了许多研究。

2001年，A K Kowal等人验证了大肠杆菌来源的glutaminyl-tRNA合成酶变体及改造的人源琥珀密码子抑制tRNA，在酵母细胞中氨酰化的可行性（图5）。

因此在专利风险层面，对于改造AARS和tRNA的组合方案来说，大概率已经不再有宽泛的基础专利层面的潜在风险（例如仅限定包含突变的AARS，不限定任何突变类型或序列）。此外，由于第二类策略主要依托于其“重构的新的翻译系统”，新系统中涉及的组件较多，因此除了需要整体考虑系统组成的潜在侵权风险外（例如US9102932B2，授权的保护范围限定了AARS序列同源性和非天然氨基酸类型等），还需警惕来自单一组分的潜在风险，例如仅涉及保护具体AARS酶序列的WO2022245902A2。

对应的从专利保护的角度来说，这个“重构翻译系统”中的任意组分均可以尝试单独进行保护，比如单独保护改造的AARS变体、非天然氨基酸以及工程化tRNA。另外，也可以尝试通过以组合的形式进行保护。此外，考虑到整体方案后续存在细节优化的可能性，因此在围绕产品方案进行专利布局规划时，一方面需要控制好各个专利申请中方案之间的关系，避免由于在先申请信息的过多披露影响后续优化方案的保护，另外一方面，后续优化方案进行申请保护时，也应基于优化方案解决的技术问题，针对性的准备具有更优效果的实验数据，以争取合理的保护范围。

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