地诺单抗的开发之路
上世纪90年代，重组DNA技术和测序技术的发展使得治疗性蛋白质药物的开发变得更加容易，denosumab的开发始于骨保护素 (OPG)靶点的鉴定、历经融合蛋白的失败、最终诞生了全人源抗体denosumab。
发现骨保护素 (OPG)
20世纪90年代初，Amgen致力于鉴别新型基因和蛋白质以开发新药。期间，Amgen的科学家们发现了一种特别的TNFR家族成员OPG，并发现表达OPG的转基因小鼠的骨密度有所增加，后期实验验证OPG可以抑制破骨细胞的形成，从而导致骨密度的增加，OPG的这一作用机制对于人们更加深入了解骨形成和骨调节的过程具有“里程碑”式的意义。
Amgen为此申请了专利保护并获得了授权 (US6613544B1)，US6613544B1保护编码骨保护素的核酸、以及相应的表达载体和宿主细胞。比如，权利要求3要求保护：
“An isolated nucleic acid encoding a full-length polypeptide having the biological activity of increasing bone density wherein the nucleic acid hybridizes under high stringency conditions corresponding to 5×SSC, 50% formamide and 42 oC., and washing at 0.5×SSC at 55 oC. with the complement of the sequence as shown in FIG. 2B (SEQ ID NO:1), FIG. 9A (SEQ ID NO:3) or FIG. 9B (SEQ ID NO:5).”
US6613544B1的权利要求3保护编码多肽的核酸，一方面限定多肽具有提高骨密度的生物活性，另一方面通过杂交特性对核酸分子进行了限定。
Amgen还以US6613544B1为母案递交了一系列的延续申请或分案申请，这些专利都围绕骨保护素进行保护，比如延续案US6369027B1保护骨保护素多肽以及OPG多聚体；分案US6284740B1保护使用编码骨保护素的核酸来提高哺乳动物骨保护素水平的方法。
OPG在RANK/RANKL通路中的作用探索
在对OPG进行表征后，后续人们尝试鉴别结合OPG的配体，通过使用OPG-Fc融合蛋白筛选获得了OPGL，并发现OPGL可以刺激破骨细胞分化。
为了开发新的疗法，Immunex公司通过髓系树突状细胞的cDNA文库进行测序以鉴定TNFR超家族 (以此方法开发了重磅药Enbrel®)，在这个过程中，他们鉴定出了一种新型TNFR同系物NF-κB受体活化因子—RANK，接着通过表达克隆方法在小鼠胸腺瘤细胞中鉴定出了NF-κB受体活化因子的配体—RANKL并获得了专利授权 (US6242213B1)。
US6242213B1保护编码RANKL的DNA分子以及相应的表达载体、宿主细胞和制备方法，权利要求1保护编码RANKL的DNA分子并限定了多肽的氨基酸序列：
“An isolated DNA molecule encoding a RANK-L polypeptide that binds RANK, wherein said polypeptide comprises amino acids 1 to 317 of SEQ ID NO:13.”
后来人们发现OPGL与RANKL序列相同，并通过实验验证了OPG在RANK/RANKL信号传导途径中的作用：OPG作为一个诱饵受体，可以与成骨细胞上的RANKL结合，阻断成骨细胞和破骨细胞前体之间的RANKL-RANK相互作用，从而抑制破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞。这也说明OPG在抑制骨吸收中具有治疗价值。
从OPG-Fc融合蛋白转而开发抗-RANKL抗体
考虑到单纯的全长OPG在体内容易与肝素结合从而表现出较差的药代动力学特征，因此科学家们考虑将OPG与IgG1抗体的Fc区融合以改善其药代动力学特性和生物活性。但临床一期试验显示OPG的重组融合蛋白在安全性上存在问题，因此决定终止融合蛋白的开发转而开发靶向RANKL的单抗。
Amgen针对OPG与Fc的融合蛋白的治疗用途申请了专利，比如US20060019887A1申请保护使用OPG多肽治疗肿瘤骨转移的方法，不过未获得授权。US7005413B1保护使用包含IL-1抑制剂、TNF-α抑制剂和OPG蛋白质来治疗骨质流失的方法。
基于转基因小鼠平台和亲和力筛选，Amgen得到了具有高亲和力的全人源抗体AMG 162 (即为denosumab)。
适应症拓展
临床试验结果证明denosumab可以减少骨吸收并提高骨质量和骨强度，因此可以用来治疗骨质疏松。
此外，在肿瘤治疗应用中，RANKL在骨转移或多发性骨髓瘤中的表达量提高，从而导致破骨细胞活性增加和骨质溶解，通过抑制RANKL可以阻止肿瘤转移引起的骨质溶解和肿瘤生长。因此，denosumab在肿瘤治疗中也具有应用价值。
2010年6月，FDA批准denosumab (商品名：Prolia®)用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症，之后又获批用于治疗男性骨质疏松、前列腺癌的雄激素剥夺治疗导致的骨量流失以及乳腺癌的芳香化酶抑制剂治疗导致的骨量流失。
同年11月，依据三项随机对照三期临床研究结果，FDA批准了denosumab (商品名：Xgeva®)用于治疗实体瘤骨转移患者的骨骼相关事件 (skeletal-related events，SREs)，之后又获批治疗骨巨细胞瘤和恶性高血钙症。与SREs的标准护理方法唑来膦酸相比，Xgeva®的肾功能毒性较低，并且效果与唑来膦酸接近甚至略胜一筹。
2017年，Prolia®和Xgeva®的全年销售额一共达到了35亿美元，由于骨质疏松患者的基数较大，预期Prolia®的销售额将持续保持增长。另外，Amgen还在不断拓展Prolia®和Xgeva®的新适应症，比如：2017年10月，FDA接受了Prolia®用于治疗糖皮质激素导致的骨质疏松症的上市申请；2018年1月，FDA批准Xgeva®治疗多发性骨髓瘤患者的SREs。Xgeva®治疗骨巨细胞瘤和恶性高血钙症的应用还获得了孤儿药资格认证，孤儿药市场保护期将分别于2020年6月和2021年12月到期。
保护denosumab的专利
以Immunex为申请人的专利
由于RANKL靶点是由Immunex最初得到的，他们构建了一系列围绕RANKL的专利家族，即以US6242213B1为母案的专利家族。比如US6740522B2保护结合RANKL的抗体；US7744886B2保护使用结合RANKL的抗体来干扰RANK信号传导的方法。
这两个专利的保护范围都涵盖denosumab，US7744886B2已经于2017年12月到期，US6740522B2获得了1365天的专利期延长，将至2021年9月到期。
以Amgen为申请人的专利
2002年，Amgen递交了保护denosumab的专利申请并获得授权 (US7364736B2)，US7364736B2保护靶向RANKL的抗体，并限定了抗体的重链和轻链序列。权利要求1保护：
“An isolated antibody comprising:
a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and
a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.”
US7364736B2的延续案US8058418B2保护编码抗体重链和轻链的核苷酸，对抗体重链和轻链的CDR序列以及抗体的功能进行了限定。权利要求1保护：
“A composition comprising a first polynucleotide and a second polynucleotide, wherein the first polynucleotide encodes a heavy chain comprising CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 13 and the second polynucleotide encodes a light chain comprising CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 14,
wherein an antibody comprising the heavy chain and the light chain interacts with a human osteoprotegerin ligand (OPGL) and inhibits binding of human OPGL to an osteoclast differentiation and activation receptor (ODAR).”
US7364736B2和US8058418B2分别将至2025年2月和2023年11月到期。
此外，Amgen还获得了保护使用US8058418B2中涉及的抗体治疗骨质流失的方法专利US8409578B2，将至2022年6月到期。
2001年，Amgen收购Immunex，一并获得了Immunex所拥有的知识产权。
围绕研发历程的专利申请
从靶点发现、机理探究到药品开发，denosumab可谓是将靶点转换为重磅生物药的一个经典案例。当然，这其中还凝聚了许多科学家大量的研究工作以及巨额的成本投入。专利申请贯穿始终，为之后产品上市带来的回报提供保障。
* 以上文字仅为促进讨论与交流，不构成法律意见或咨询建议。