CAR-T细胞疗法

CAR-T细胞是一种经基因工程化的T细胞，通常表达能识别特定肿瘤抗原的CAR (chimeric antigen receptors，嵌合抗原受体)，进而激活免疫系统以消灭肿瘤。CAR通常包含三个结构域：识别肿瘤相关抗原的胞外域 (如，scFv)、信号传导结构域 (例如，CD3 zeta)和一个或多个胞内共刺激结构域 (例如，可源自CD28、4-1BB、OX40等)。

目前，CAR-T主要用于治疗血液肿瘤 (如B细胞恶性肿瘤)，其中靶向CD19的CAR-T疗法已取得了激动人心的治疗效果，而人们也在尝试用CAR-T来治疗其它类型的血液肿瘤，甚至实体瘤。

2017年8月和10月，FDA相继批准了Novartis和Kite的CAR-T产品KYMRIAH^® (tisagenlecleucel)和YESCARTA^® (axicabtagene ciloleucel)，这两款产品都是靶向CD19的CAR-T细胞。

目前FDA已经批准的两款产品都是利用患者自身的T细胞进行修饰的，这种方法的优点是较少出现免疫原性问题，制备过程可以简单描述如下：

将来自患者自身的T细胞在离体 (ex vivo)条件下经过基因工程的方法进行修饰和扩增后得到所需的CAR-T细胞，然后回输至患者体内。主要包括以下步骤：

步骤1：利用白细胞分离术收集白细胞，进一步分离并富集T细胞

步骤2：培养步骤1中获得的T细胞，利用人造抗原呈递细胞活化T细胞，并施加装载有CAR核酸序列的病毒载体

步骤3：在生物反应器中扩增T细胞

步骤4：对扩增产物进行洗涤并浓缩

步骤5：经过质控和审查后，对产品进行冷冻保存

步骤6：产品经解冻输注至患者体内

下面我们就以中国的专利保护情况为例，来看看上面这个过程中可能在哪些环节存在何种专利壁垒。

CAR-T相关的中国专利

T细胞富集环节

Juno于2015年申请的中国专利CN106459917A涉及一种T细胞富集方法，例如，权利要求1请求保护：

1. “一种富集CD⁴⁺或CD⁸⁺T细胞的方法，所述方法包括： (a) 在封闭系统中进行第一选择，所述第一选择包括:从包含原代人Τ细胞的样品中针对 (i)CD⁴⁺细胞和 (ii)CD⁸⁺细胞之一进行富集，所述富集由此产生第一选择群和未选择的群;和 (b) 在所述封闭系统中进行第二选择，所述第二选择包括:从所述未选择的群中针对 (i)CD⁴⁺细胞和 (ii)CD⁸⁺细胞中另一者进行富集，所述富集由此产生第二选择群，其中，所述方法产生富集的组合物，其针对CD⁴⁺细胞和CD⁸⁺细胞富集，并且包括第一选择群的细胞和第二选择群的细胞。”

可见，该方法涉及如何从人Τ细胞的样品中，分别针对CD⁴⁺细胞和CD⁸⁺细胞进行筛选和富集。

病毒转导环节

Juno的另一个中国专利申请CN107109438A涉及病毒转导方法。其中，权利要求1如下：

1. “一种转导方法，其包括:在离心室的内部空腔中孵育输入组合物，该输入组合物包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒，其中该离心室能围绕旋转轴旋转，并且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，该侧壁的至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出；该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；及该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。”

这个权利要求描述的就是一种在特定装置中，用病毒转导细胞的方法，最后获得经转导的细胞。

细胞扩增环节

再来看一个Juno的中国专利申请CN106414724A，其涉及一种细胞扩增方法，权利要求1如下：

1. “一种扩增细胞群的体外方法，其包括使包含细胞群的样品与多聚化剂接触，其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试剂；其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及其中，所述第一试剂与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞。”

可见，这个权利要求描述的是利用多聚化剂来激活细胞，从而使细胞群扩增的方法。

CAR或CAR-T

CAR的结构组成决定了T细胞结合的抗原种类，进而刺激T细胞发挥治疗作用，因此，围绕“CAR”和加载了“CAR”的T细胞的专利申请可谓是最重要的一类专利。

例如，Novartis的一篇中国专利申请CN105392888A涉及编码嵌合抗原受体的核酸分子，权利要求1如下：

1. “编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中该CAR包含包括人源化抗CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、和包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，其中所述抗CD19结合结构域包含表3所列任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)之一个或多个、以及表3所列任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2 (HC CDR2)和重链互补决定区3 (HC CDR3)之一个或多个。”

可见，其限定了CAR包含结合CD19抗原的人源化结合结构域的抗体或抗体片段，并进一步限定了轻链和重链的序列。

再例如，宾夕法尼亚大学递交的一篇中国专利申请CN106220739A也涉及CAR，其权利要求1如下：

1. “分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域；其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任何组合；和/或所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任何组合。”

可见，该权利要求中，对抗原结合结构域和共刺激信号传导区的限定都相当宽泛，相信后续审查过程中将通过修改进一步限定。

宾夕法尼亚大学的另一个中国专利申请CN107206024A涉及一种经修饰的T细胞，其权利要求1如下：

1. “修饰的T细胞，其包括：能够下调内源基因的基因表达的核酸，所述内源基因选自TCRα链、TCRβ链、β-2微球蛋白、HLA分子、CTLA-4、PD1和FAS；和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体(CAR)包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的胞内结构域。”

可见，该专利申请涉及的是通用型CAR-T (allogeneic CAR-T)细胞，其中通过下调某些内源基因的表达而降低免疫原性，以期提供“off-the-shelf”的CAR-T产品。

当然，说到通用型CAR-T细胞，就一定要提到Cellctis公司，Cellectis利用TALE-核酸酶基因编辑技术敲除T细胞中表达T细胞受体 (TCR)的基因而开发了通用型CAR-T。例如，Cellctis公司在中国递交了专利申请CN104718284A，其权利要求1如下：

1. “一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括：(a)通过灭活至少以下各项改变T细胞：表达免疫抑制剂的靶标的第一基因，和编码T细胞受体(TCR)的组件的第二基因，(b)可选地在所述免疫抑制剂的存在下，扩增所述细胞。”

灭活表达免疫抑制剂靶标的基因是为了提高工程化T细胞对免疫抑制药物的耐受性，而灭活编码TCR的组件的基因是为了降低移植物抗宿主反应，这些都为通用型CAR-T细胞的应用奠定了基础。

质控环节

宾夕法尼亚大学递交的另一个中国专利申请CN104619723A涉及分析基因修饰的T细胞中污染物的方法，其权利要求1如下：

1. “分析基因修饰的T细胞以检测污染物的方法，其中所述基因修饰的T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域。”

可见，该方案涉及的是对所获得的细胞产品进行质量控制的方法。

治疗方法、用途及药物组合物

例如，Juno的中国专利申请CN107106610A涉及一种治疗方法及相应的药物组合物，其权利要求77如下：

1. “一种包含用于治疗对象中疾病或病症的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的组合物，其中所述细胞经配制和/或包装用于以第一和连续剂量给予对象和/或所述治疗包括以第一和连续剂量向对象给予细胞，其中：

所述第一剂量包含不超过约1x10⁶个细胞/千克对象体重，不超过约1x10⁸个细胞，和/或不超过约1x10⁸个细胞/m²对象，并且

所述连续剂量选自：

i)用于在以下时间点给予的连续剂量：(a)第一给予开始后至少或超过约14天后并且不到约28天，和/或(b)(i)所述对象中指示细胞因子释放综合征(CRS)的因子的血清水平是所述第一给予之前即刻的所述对象中的不到约10倍，不到约25倍，和/或不到约50倍；(ii)所述对象没有显示3级或更高神经毒性；(iii)所述给予第一剂量后所述对象中的神经毒性的症状或CRS-相关结果已经达到峰值水平并且在所述第一给予之后开始下降，和/或(iv)所述对象没有显示针对所述第一剂量的细胞表达的CAR的可检测的体液或细胞介导的免疫应答；和

ii)包含与第一剂量中的CAR-表达细胞的数量大约相同数量的CAR-表达细胞的连续剂量，或与第一剂量相比数量增加的CAR-表达细胞的连续剂量。”

由于治疗方法在中国是非授权主题，权利要求写成上述模样也真是挺难为专利律师的。

组合拳

上面介绍的多是涉及生产的某个环节的专利，而Kite的中国专利申请CN106459915A则涉及了从细胞富集到细胞扩增的整个制备过程，例如，权利要求1如下：

1. “一种制造表达细胞表面受体的T细胞的方法，所述细胞表面受体识别靶细胞表面特定抗原部分，所述方法包括：富集获自供体对象的淋巴细胞群体；用一种或多种T细胞刺激剂刺激所述淋巴细胞群体，从而产生激活的T细胞群体，其中所述刺激是使用无血清培养介质在封闭系统中进行的；用包含编码所述细胞表面受体的核酸分子的病毒载体对所述激活的T细胞群体进行转导，使用单循环转导以产生转导的T细胞群体，其中所述转导是使用无血清培养介质在封闭系统中进行的；对所述转导的T细胞群体扩增预定的时间以产生工程化T细胞群体，其中所述扩增是使用无血清培养介质在封闭系统中进行的。”

虽然，大部分CAR-T领域的中国专利申请尚未获得授权，但鉴于主要玩家们在其它国家和地区的专利纠纷不断，在中国进行CAR-T研发的企业们还是应该密切关注各个生产环节中的重要专利，尽早鉴别出可能的法律风险并合理应对。此外，该领域的现有技术状况错综复杂，专利申请非常密集，进行CAR-T研发的企业在相关专利申请和布局方面，也应只争朝夕。

* 以上文字仅为促进讨论与交流，不构成法律意见或咨询建议。